诊断学第七版教材-第128章
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是单个碱基的置换。现今，人们认为基因组中的这类多态性有助于解释个体间的表型差
异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病易感性的差异，以及对各种药物的耐受性
和对环境因素反应不同。SNP作为一种遗传标记具有以下特性：
（1）密度高：它在基因组中的分布比微卫星标记广泛，可以在任何一个待研究基因的
内部或附近提供一系列标记。
（2）具有代表性：某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或表达水
平，因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点，可能代表疾病遗传机理中的某
些作用因素。
（3）遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性，
尤其是处于编码区的SNP（cSNP）。SNP一般只有2个等位基因，即是二态的，故又称双
等位基因标记（bialleic：marker…），其在任何人群中的等位基因频率都可估计出来。
（4）分析易实现自动化：由于SNP是双等位基因标记，容易进行自动化批量检测，
分析也相对简单，不需要像检测RFLP及微卫星多态标记那样进行片段长度的测量。缩短
了研究时间。目前已有多种方法可用于sNP检测，如根据DNA阵列的微测序法、动态等
位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。不管哪一种方
法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其他检测。
（八）基因芯片技术
基因芯片（gene chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将大量已知的寡核苷酸分子
固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中
靶分子的数量。基因芯片技术集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子
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合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使基因芯片具有微型化、集约化和标准
化的特点，实现了对靶基因快速、高通量的检测。
基因芯片在医学领域中具有广阔的应用前景。①在优生方面：目前知道有600多种遗
传疾病与基因有关。妇女在妊娠早期用DNA芯片做基因诊断，可以避免许多遗传疾病的
发生。②在疾病诊断方面：由于大部分疾病与基因有关，而且往往与多基因有关，因而，
利用DNA芯片可以对一些疾病进行诊断。③在器官移植、组织移植、细胞移植的基因配
型方面：如可用于HLA分型。④病原体诊断：如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定。
⑤在环境对人体的影响方面：已知花粉过敏等人体对环境的反应都与基因有关。⑥在法医
学方面：DNA芯片比早先的DNA指纹鉴定更进一步。
四、基因诊断在临床医学中的应用
（一）遗传性疾病的基因诊断
遗传性疾病往往有基因突变或存在连锁不平衡，因此可以通过基因突变检测技术或利
用DNA多态性连锁分析对遗传性疾病作出诊断。如：镰刀状红细胞贫血、血友病、地中
海贫血、脆性x综合征等均可应用分子生物学技术对其进行基因诊断。下面以a地中海贫
血（简称a地贫）为例，说明基因诊断在遗传性疾病诊断中的作用。a地贫是由于a链基
因的完全或部分缺失所致的a珠蛋白合成减少的血红蛋白病。首先可从DNA水平进行诊
断：过去是从羊水细胞中提取DNA，用标记的a珠蛋白探针通过液相杂交技术对a珠蛋
白基因缺失的程度进行检测。但液相杂交技术不够灵敏，现多采用限制性内切酶酶谱分析
技术，通过观察酶切图谱条带来进行诊断，若正常条带消失或出现异常条带，则表明由a
珠蛋白基因的改变（如缺失、突变等），从而对其进行诊断。从RNA水平进行诊断：由于
a珠蛋白基因的改变，导致a珠蛋白mRNA含量减少，因此可以应用RT—PCR的方法检
测患儿红细胞中a的珠蛋白mRNA，从而对a地贫进行诊断。
（二）感染性疾病的基因诊断
过去常采用形态学、生化学及血清学的方法对感染性疾病进行诊断，但由于痫原体侵
入人体后需潜伏一定时间后才会出现抗体或生化方面的改变，因此血清学和生化学方法很
难对其进行及时的诊断。感染性疾病确诊的方法需要从细胞、血液或分泌液中分离培养出
病原体，这些方面复杂、费时。基因诊断灵敏度高，克服了传统方法的不足，病原体侵入
机体初期就能被检测到，且可对病原体基因进行定量，从而判断该病原体是否处在复制
期，还可帮助临床医生监测治疗药物的疗效。应用分子生物学的方法不仅可以检测DNA
病毒，还可以检测RNA病毒。目前可检出的病原体有：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、
人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、疱疹病毒、结核分枝杆菌、产毒性大肠杆菌、奈
瑟淋球菌、肺炎支原体、疟原虫、利什曼原虫、白色念珠菌等。
（三）肿瘤的基因诊断
肿瘤的形成是遗传因素与环境因素相互作用的结果，随着肿瘤分子生物学的发展，人
们对肿瘤的认识已经发展到基因水平，发现了许多肿瘤相关基因，对癌基因、原癌基因和
抑癌基因有所了解。
（1）癌基因：是指能参与或直接导致细胞发生恶性转化的基因。癌基因可分为两大
类：一类是肿瘤非特异性癌基因，如H—ras、K—ras、c—myc等基因，在肝癌、肺癌、结直
肠癌等许多肿瘤中可检测到；第二类是肿瘤特异性癌基因，如C属于非特异性癌基因；c…sis
与淋巴结肿瘤转移有关，c…abl与慢性髓性白血病有关。
（2）原癌基因：指存在于正常细胞内，在一定的因素刺激下可转变为癌基因的基因序
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列。其编码的产物可在细胞膜、细胞质、细胞核和细胞外。
（3）抑癌基因：是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因
的丢失或失活可能导致肿瘤发生。如野生型P53为抑癌基因，当其发生点突变、插入突
变、缺失突变时将会失去抑癌的作用，它的失活对于肿瘤的形成具有重要的作用。迄今为
止发现许多肿瘤中存在P53基因的突变，如肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤等。随
着分子生物学技术的发展，我们可以应用分子生物学技术检测肿瘤相关基因，从而对癌症
进行早期诊断、对其组织学的恶性程度进行判断等。
（四）基因诊断在法医学中的应用
1983年Jeffreys等在人体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，同一个体不
同组织来源的DNA被同一酶降解后的Solnhern印迹图上的条带完全一样，而不同个体之
间（除非同卵双生）的谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种
SouIthei…n印迹图被称为DNA指纹。法医学常将此种技术用于刑事案件中的物证来源进行
鉴定和民事案件中的亲子鉴定。
第二节 流式细胞术及其临床应用
一、流式细胞术
流式细胞术（flow cytomet：ry，FcM）是一种集细胞生物化学技术、单克隆抗体技术、
激光技术、流体力学、电子技术、计算机技术、分子生物学、临床医学等理论于一体的现
代分析技术；能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功
能状态等进行定性或定量检测，并在必要时进行分类收集的多参数检测细胞分析技术，使
用的是流式细胞仪（flow cytometry）。
二、流式细胞仪组成及其工作原理
流式细胞仪由流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光电检测及信息处
Ill 理系统和细胞分离纯化系统等部分组成。经染色的
激光 细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦
＼观测点 点，单个细胞在高压氧压力下流速极快，每秒可通
过5000～10 000个细胞。当细胞或微球经过焦点
时，发出一束散射光和（或）荧光，并经过滤光镜
系统收集到达一个光电检测器（光电倍增管或一个
板 固态装置），光检测器把光信号定量转化成电信号，
经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电
子存储数据（图4—10一2）。数据可以调出，并以直
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三、流式细胞术的临床应用
近年来，随着流式细胞仪性能的不断改进、测定方法与技术的迅速发展、高质量试剂
的研制，使得流式细胞技术已在基础医学、临床医学及科学研究中有着广泛的应用。尤其
是流式细胞仪迅速进入临床实验室，一些检验项目已成为辅助临床疾病诊断、选择治疗方
案、预后判断等方面的重要手段。
（一）免疫学
利用FCM可进行免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析；免
疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。
流式细胞膜免疫表型分析是流式细胞技术最主要的分析内容之一，很多细胞亚群的检
测均是以膜免疫表型为主，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析等。
流式细胞技术可对混合细胞群体中亚群细胞进行分类检测，如淋巴细胞可依其表面标
志的不同分为T淋巴细胞（CD3’）、B淋巴细胞（CDl9。）、NK细胞（CD3一／CDl6。56’），
T淋巴细胞又可进一步分为辅助／诱导T淋巴细胞（CD3’／CD4’／CD8一）和抑制／细胞毒T
淋巴细胞（CD3’／CD4一／CD8’）等。目前淋巴亚群细胞分类多以相对百分比表达结果，但
由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现在单位体积血液
中的绝对数量，而临床一些疾病的诊断需要考虑细胞的绝对数量，如艾滋病患者的血液中
辅助／诱导T细胞（CD3。。／CD4’／CD8一）
200个／肚1。淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，而目前国内开展较
少，但是由于其检测的重要性，淋巴细胞亚群的绝对计数是实验室检测发展的趋势。
FCM通过对人白细胞抗原（HLA）配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最
合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测。造血干／祖细胞移植加强烈化疗是
治愈某些难治性疾病的有效方法；它不仅可以用于某些恶性血液病的治疗，，而且还可以用
于其他恶性实体瘤的治疗。骨髓移植或外周血造血干细胞移植（PBS（：T）的成功与否，除
了与是否合并并发症有关外，移植物中CD34‘细胞的数量和质量是快速成功植活的重要因
素。精确测定CD34阳性细胞对于判断移植后的植活和选择G—CSF动员外周血干细胞的
采集时间有重要指导意义。
外周血HLA一：B27的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生有很大程度的相关性，
运用HLA—B27／HLA—B7双标记特异性单克隆流式抗体检测抗原，可同时排除交叉反
应，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高。
然而仅有膜免疫表型的分析是不够的，尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常
较为困难，而细胞浆或细胞核内成分则更能反映某些
